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人外周血淋巴细胞培养_干细胞搜网_www.stemcell.so

发布时间:2014-05-13

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干细胞搜网实验室人员教您如何做好人外周血淋巴细胞培养

 

在正常情况下,人外周血中是没有分裂相的,只有在异常情况下才能发现。植物血球 凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在PHA作用下,原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞,进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性,淋 巴细胞经过含有HPA培养液培养,在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体,终止分裂中期的淋巴细胞,例可得到所需的人体染色体图形。具有用 血量少、操作简单等优点。

  1、实验材料
  2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液(PRMI 1640、M199)、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、载玻片等。

  2、培养液配制
  无菌条件下配制培养液,每瓶所含下列试剂:
  RPMI 1640或199 90%
  小牛血清 10%
  PHA(自制) 0.1ml 3%
  肝素 10u/ml 2%
  双抗 100u/ml(选择)
  分装于10ml培养瓶内,每瓶5ml培养液,封口置冷藏柜备用。

  3、操作过程
(1)采样接种:用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶盖,用酒精灯火焰过烤,无菌条件下抽取患者外周血0.5-1ml,每瓶加20滴左右,轻摇均匀,尽量避免培养物与瓶盖接触;
(2)培养:置36℃培养箱中培养72小时,每隔12小时左右轻遥1次,以促进细胞生长增殖;
(3)抑止分裂:收获前2小时左右加秋水仙素,zui终浓度为0.02ug/ml培养液,摇匀后置培养箱中继续培养,以抑止细胞在分裂中期。
(4)终止培养:从培养箱中取出培养瓶,摇匀后移至10ml尖底离心管中,尽量收集培养细胞。2000rpm8分钟。
(5)低渗处理:弃上清液,加入预温37℃的0.075MKCL8ml,迅速打匀,置37℃培养箱或水浴锅中10-20分钟;
(6)预固定:取出低渗中尖底离心管,轻轻加入新配制的1-2ml 3∶2甲醇:冰乙酸混合液,取相应编号滴管用汽泡轻轻软打2-3下。800-1000rpm8-10分钟;(7)固定:弃上清液。加入新鲜配制的3∶2甲 醇冰乙酸混合液10ml,轻打混匀,封口置室温30分钟以上。1500-2000rpm10分钟,反复2-3次;
(8)制片:使用蒸馏水制备冰水片进行滴片。留离心后沉淀细胞,加新鲜配制的固定液,制成细胞悬液,取1-2滴滴片,用于轻轻吹开。刻号后清理刻号污物,置80℃烤片2小时;
(9)收片:待烤箱自然冷却后,取出烤片,置干净环境中或培养箱中以备进行显带处理。

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