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上皮细胞培养_干细胞搜网_www.stemcell.so

发布时间:2014-05-13

阅读:77

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干细胞搜网实验室人员教您如何做好 上皮细胞培养

 

1)表皮细胞培养
1.取材:取外科植皮或手术残余皮肤小块,以角化层薄者为佳,早产流产儿皮肤更好,切成0.5~1平方厘米小块。
2.EDTA处理:先置入0.02%EDTA中室温置5分钟。
3.冷消化:换入0.25%胰蛋白酶中,置4℃过通宵。
4.分离:取出皮肤,用血管钳或镊子把表皮与层分开。
5.温消化:取出表皮单独处理,用剪刀剪成更小的块后,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化30~60分钟。
6.用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液。
7.培养液:通过80目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清,制成细胞悬液,接种入碟皿中,CO2温箱培养。

 

2) 乳腺组织培养
直接培养法:(适于培养含纤维少的软组织)
1.在含有少量培养液或Hanks液的容器中,用锋利刀片将组织反复切割成碎块。
2.把组织碎块连同液体注入离心管中,再补加少许培养液,用吸管吹打片刻,置试管架3~5分钟。吸除上层液可排除非乳腺细胞部分。重复2~3次。
3.末次处理结束后,向沉降管中再补加培养液,用吸管稍吹打,使沉降物重悬。不待细胞团块下降立即通过3~4层无菌纱布滤入另管中。
4.调整好适宜密度,接种入培养瓶中培养。

胶原酶消化法:(适于处理含纤维多的较硬组织)
其过程与培养其它组织相同。

 

3) 胃上皮细胞培养
1.取材:取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许。
2.清洗:用含庆大霉素(400微克/毫升)和二性霉素(2微克/毫升的Hanks)液漂洗后,用钝器剥离下粘膜,剪成1mm3大小。
3.消化:在I型胶原酶和透明质酸酶中,于37℃中消化80分钟。
4.离心:收集细胞悬液,800转/分离心后,Hanks液漂洗两次。
5.接种:末次离心后加入含有1%~2%胎牛血清的完全培养基,接种入不同孔数的培养板中,接种量依不同实验目的而定。

4) 肝细胞培养
初代组织块培养:
取新鲜肝脏,先剥除被膜和血管等纤维成分,用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3左右的小块,采用帖壁培养法。

 

初代消化法培养:
1.把肝组织切成2~4立方毫米的小块,用不含钙镁的BSS液洗两次。
2.移入1:1的0.1%胰蛋白酶和0.1%胶原酶(都用无钙镁BSS配置)中,4℃冷消化10~12小时后,通过250微米和64微米尼龙网或不锈钢纱网滤过。
3.收集细胞、BSS液洗1~2次、计数、接种培养。
消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法;肝脏灌流需用全肝,以较小动物如小鼠和大鼠为好。
1.无菌解剖动物,取出肝脏,先用BSS洗除血污。
2.取5ml注射器一支,吸取消化液后,把注射器头轻轻插入肝管中,用线绳结扎牢固,以防消化液漏出,轻轻把消化液注入肝管系统,并不时轻揉压肝脏,以便消化液进入肝小叶中;消化液在肝内停留20~30分后,在吸出消化液的同时并轻揉压肝脏,以使肝细胞脱落和消化液吸出。
3.待吸净消化液后,注入离心管中,低速离心分离,用RPMI 1640培养基培养(较其它培养基为好),能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。

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