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蛋白样品制备详解—酶类篇

发布时间:2021-09-09

阅读:115

   当细胞破碎的时候,蛋白水解酶就会被释放出来或被激活,使电泳结果复杂化,影响最终结果分析。为了避免这些情况的出现,建议在样品制备时尽可能在低温下进行。此外,许多蛋白酶在PH9以上就失活了,因此Tris碱,碳酸钠或碱性载体两性电解质往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性,此时应当使用蛋白酶抑制剂。因此对于我们想要研究的蛋白来说,选择性和有效的抑制这些蛋白酶对于蛋白纯化路线设计来说显得尤为重要。

  蛋白酶抑制剂与蛋白酶一样,都是纷繁复杂的,通常使用许多化学物质作为蛋白酶抑制剂,如PMSF 和leupeptin。而且由于一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用,因此通常建议复合使用蛋白酶抑制剂,如广谱蛋白酶抑制剂“鸡尾酒",见下表(来自《蛋白质电泳实验技术》)。

蛋白酶抑制剂

有效抑制的酶

PMSF(Pheylmethylsulfonyl fluoride)是很常见的抑制剂,使用浓度为1mmol/L 

不可逆抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。

AEBSF 丝氨酸抑制剂,使用浓度为4mmol/L 

AEBSF的抑制活性与PMSF相近,但它更易溶于水而且毒性低

EDTA,EGTA,使用浓度为1mmol/L

通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。

多肽蛋白酶抑制剂,使用浓度为2-20ug/ml 

亮肽素(Leupeptin)能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶;抑肽素(pepstatin)抑制天冬氨酸蛋白酶;抑肽酶(aprotinin)能抑制许多丝氨酸蛋白酶;苯丁抑制剂(bestatin)能抑制氨基酸多肽酶

TLCk,TPCK,使用浓度为0.1-0.5mmol/L 

不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶

苄脒(Benzamidine)使用浓度为1-3mmol/L 

抑制丝氨酸蛋白酶

  但是这样配置溶液进行处理,有时也是颇为麻烦,而且效果可能并不好,目前有一些厂家试剂在简便操作,和抑制效果方面有不俗的表现,可以考虑在实验中选用,节约时间和便于结果分析。

  比如,G-BiosciencesProteaseArrest™蛋白酶抑制剂也许就能满足这种需要,ProteaseArrest™是一种常规的蛋白酶抑制剂混合物,提供100X浓缩的即用溶液。这种100X浓度的溶液适用于小量,分析样本的应用。在1ml样本中加入10微升的ProteaseArrest可以达到大于95%的抑制效率。对于样本中含量高的蛋白酶的情况,可以适当增加ProteaseArrest的量来达到更大的抑制效率。

  抑制剂混合物包括针对丝氨酸、半胱氨酸、钙蛋白酶和金属蛋白酶可实现可逆和不可逆的抑制。可选择的EDTA的溶液可实现增强的金属蛋白酶的抑制。EDTA并不存在于ProteaseArrest混合物溶液中,它将抑制那些需要二价阳离子(Ca2+, Mg2+ Mn2+)来起作用的蛋白质的活性。除此之外,EDTA会抑制那些通过使用固定金属亲和层析色谱纯化得到的蛋白,也包括6XHis标签重组蛋白。

  由于各种抑制剂组分的最优化的浓度,ProteaseArrest表现出优异的蛋白酶活性的抑制,因而它适合在从动物组织,酵母,植物和细菌中进行蛋白纯化和样本制备过程中来保护蛋白。

  ProteaseArrest也有独立包装的小包装,能够在10ml的溶液中达到大于95%的抑制效率。这种OneQuant™小包装主要是为了科研人员方便使用。

  实重要的是ProteaseArrest也可以根据实验的情况来优化蛋白酶抑制剂的浓度,比如组织中含有高于常规量的蛋白酶的时候,可以加入2X或者更高浓度的ProteaseArrest的量。

在研究中,发现1X浓度的ProteaseArrest的蛋白酶抑制效率达到了95%0.5mg/ml的小鼠的胰腺提取物为例)。

 

  除了蛋白酶抑制剂以外,在许多研究过程中,尤其是一些制药公司和研究院在研究药理学机制的时候,需要了解蛋白磷酸化途径,因此一个重要的步骤就是准确的观察一般和特异的磷酸化状态,所以蛋白抽提的另一个重要保护过程就是对磷酸化状态的有效保护。

  磷酸化的蛋白可以被非特异性的磷酸酶(例如:碱性磷酸酶),特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、酪氨酸蛋白磷酸酶或双重特异性磷酸酶去磷酸化。针对这种情况G-Biosciences也推出了一种PhosphataseArrest™磷酸酶抑制剂混合物,它能够保持细胞和组织中蛋白的磷酸化状态。PhosphataseArrest™包括3种抑制剂产品。

phosphataseArrest™ I

一种广泛的磷酸酶抑制剂混合物包括5种磷酸酶抑制剂,能够特异性的抑制丝氨酸/苏氨酸,和酪氨酸双重特异性的磷酸酶。PhosphataseArrest™ I是一种稳定的溶液组成,含有氟化钠,正钒酸钠,焦磷酸钠,β-磷酸甘油,钼酸盐等。

磷酸酶抑制剂

分子量

靶向磷酸酶

氟化钠

42

酸性磷酸酶

正钒酸钠

183.9

酪氨酸磷酸酶,碱性磷酸酶

焦磷酸钠

221.94

丝氨酸/苏氨酸磷酸酶

β-磷酸甘油

306.1

丝氨酸/苏氨酸磷酸酶

钼酸盐

205.92

酸性磷酸酶

 

PhosphataseArrest™ II

一种广泛的磷酸酶抑制剂混合物包括5种磷酸酶的抑制剂能够抑制酸性,碱性和酪氨酸磷酸酶。PhosphataseArrest™ II含有优化浓度的氟化钠,酒石酸钠,正钒酸钠,咪唑和钼酸盐。

磷酸酶抑制剂

分子量

靶向磷酸酶

氟化钠

42

酸性磷酸酶

正钒酸钠

183.9

酪氨酸磷酸酶,碱性磷酸酶

酒石酸钠

230.08

酸性磷酸酶

咪唑

68.08

碱性磷酸酶

钼酸盐

205.92

酸性磷酸酶

 

PhosphataseArrest™ III

一种广泛的磷酸酶抑制剂混合物包括3种磷酸酶的抑制剂能够抑制碱性和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。PhosphataseArrest™ III是一种稳定的,方便的溶液,由斑蝥素对溴四咪唑草酸盐肿瘤促进剂组成。

磷酸酶抑制剂

分子量

靶向磷酸酶

斑蝥素

196.2

丝氨酸/苏氨酸磷酸酶

对溴四咪唑草酸盐

373.23

碱性磷酸酶

肿瘤促进剂

1009.17

丝氨酸/苏氨酸磷酸酶

 

总而言之,在实验中适当的选择一些经过严格的质量监控的产品,想来相比较于家制的鸡尾酒而言具有更好的使用重复性,和有效性,让我们在下游应用中得到更洁净和清晰的结果。

 

华雅思创生物G-Biosciences全国授权代理

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