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蛋白样品制备详解—蛋白质保护篇

发布时间:2021-09-09

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  蛋白质是成分高度复杂的,复杂的生物大分子包括1个或多个长链氨基酸. 蛋白或肽折叠形成二级和三级结构 和其他蛋白亚基相互作用来形成四级结构。蛋白是在结构上彼此不同的同时出于稳定性和活性的目的要求不同的周边环境. 蛋白当脱离他们天然的环境后是非常容易降解变性和沉淀的

  在蛋白抽提过程中,细胞和细胞器膜是被破坏掉从而释放蛋白到溶液中使蛋白高度不稳定. 蛋白是暴露在溶液中不同的PH值,离子强度,温度和蛋白酶中. 尽管所有的蛋白是不同的他们要求不同的参数比如稳定性溶解性和活性, 然而一些因素如果处理好的话可以保证活性蛋白的抽提,能够在蛋白抽提过程中保护蛋白的组分或者因素如下:

缓冲液组分: 在蛋白抽提过程中为蛋白提供适宜的缓冲液环境是非常重要的这样蛋白可以应付突然变化的PH值。如果蛋白抽提裂解缓冲液不是蛋白适宜的缓冲液蛋白会很容易发生不可逆的变性。

一个好的蛋白抽提缓冲液必须在要求的PH值下有很强的缓冲能力,水溶性,化学稳定性,和加到蛋白抽提溶液中的其他添加物的兼容性,以及蛋白下游应用的兼容性。

大部分常规使用的生物缓冲液有 pKa 大约 7因此可以用于生理PH值下。 常用的生物缓冲液的是磷酸盐Tris, MOPS HEPES. 这些缓冲液通常使用在 20 mM浓度以上来保证足够的缓冲能力.


抽提时的温度: 来自于哺乳动物细胞的蛋白适合于他们活性的温度大约 37 °C以及许多来自于生长在37°C细菌的细菌蛋白也有蛋白稳定性的最适温度在37°C。鉴于此,我们可以预计成功的蛋白抽提在室温进行。然而溶液中的蛋白在室温中会发生降解因为溶液中蛋白的环境和细胞中的环境是不同的。溶液中蛋白没有受到如同细胞中伴侣的保护。除此之外蛋白由于存在于溶液中的内源蛋白酶从而容易发生降解。细胞中的内源蛋白酶在细胞中存在特定的小室中因此不能降解所有的细胞蛋白。蛋白酶的活性在 4°C 时会减弱通常来说蛋白的抽提应该在冰上进行从而得到活性蛋白


细胞裂解和蛋白抽提缓冲液的添加剂: 有一些可以添加到蛋白抽提缓冲液中的添加剂一些是通用的一些是和需要抽提的蛋白特定的.


: 盐类加入用来维持蛋白抽提溶液的离子强度. 加入的抽提缓冲液中的盐的浓度基于蛋白生理环境下的离子强度。太高或太低浓度的盐会导致蛋白的沉淀或变性。绝大多数用于维持蛋白抽提缓冲液中离子强度的常规使用的盐包括氯化钠,硫酸铵。

 

蛋白酶/肽酶: 蛋白酶和肽酶是可以在特定位点切割蛋白从而降解他们。有四种已知蛋白类别的蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶, 半胱氨酸蛋白酶, 天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶. 当蛋白而不是蛋白酶需要被抽提可以加入蛋白酶抑制剂来抑制蛋白的降解。特定蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合物取决于科研人员的需要有商品化的产品。使用蛋白酶抑制剂混合物是不错的选择因为人们对于细胞中存在哪些内源蛋白酶的了解是有限的。金属蛋白酶被金属螯合剂所抑制比如EDTA EGTA. 最常规使用的蛋白酶抑制剂是EDTA, PMSF, 亮肽素和 pepstatin A.

 

渗透调节物质: 渗透调节物质是影响的渗透的化合物. 渗透调节物质可以协助蛋白的折叠 他们是作为添加剂来增强蛋白在溶液中的可溶性和稳定性。在蛋白抽提过程中最常使用的渗透调节物质包括甘油, 去污剂比如 NP40和糖类如葡萄糖,蔗糖等.

 

还原剂: 还原剂可以保护蛋白免受氧化的损害. 当抽提特定性的蛋白时可以使用还原剂这些蛋白易于发生氧化损害。还原剂包括  DTT .


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