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蛋白样品制备详解—概念篇

发布时间:2021-09-09

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 蛋白样品制备是许多实验重要的第一步,蛋白样品由于其结构特性各异,又必须使其完全溶解和尽可能少的化学修饰,所以不可能有一个通用的技术,只能通过大量的实验来积累经验。正如开篇所引用的两句话中包含的深意:在研究蛋白的过程中,既需要严谨的技术流程,规范的操作手段来确保蛋白研究的完整性,也需要将其看成是独特而奇妙的个体,结合以往经验但又不拘泥于经验,才能真正揭开她神秘的面纱。2012年让我们一起来回顾一下这一重要技术及值得关注的产品。


1.为什么要进行样品制备
“为什么要进行样品制备?电泳的目的不就是分离吗?"刚接触双向电泳的小菜鸟有可能就会这么问。这个问题很好回答,这是由于目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot),而样品中的蛋白种类可达到10万种以上,因此样品的预分离制备是必须的。另外比如像对临床组织样本进行研究,寻找疾病标记的蛋白质组学研究目的,由于临床样本都是各种细胞或组织混杂,而且状态不一,如肿瘤组织中,发生癌变的往往是上皮类细胞,而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较,实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较,而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型,因此需要进行有效的样品制备。

但是为什么要进行不同步骤的样品制备呢?这不仅仅是由于蛋白本身不同,所以需要不同方法来配合,而且在制备样品的时候,首先需要明确的是什么是实验的最终目的:是分离尽可能多的蛋白还是分离样品中某些感兴趣的蛋白,这些直接决定了你的制备方法,也决定了实验的成功与否。由于想要分离的蛋白必须是完全溶解的,溶解的效果取决于裂解、破碎、沉淀、溶解的过程以及去污剂的选择和各种溶液的组成,因此如果是只对样品中的一部分蛋白感兴趣,可采取预分离的方法,如欲分析的蛋白来自细胞器(细胞核、线粒体和原生质膜),则应先采取超速离心或其他方法将细胞器分离出来再溶解蛋白;如果是希望分离出尽可能多的蛋白,比如进行全蛋白质组分析,则可以将细胞或组织中的蛋白分成几部分,分级制备。


2.G Biosciences 小贴士:制备的原则:

1. 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。

2. 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。

3. 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰(如酶性或化学性降解等)。

4. 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。

5. 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性。

以上这五项原则是科学家们的经验智慧总结,基本上可以说是囊括了样品制备过程中的抽象注意事项,之后还会提到具体的注意事项。


3.样品制备流程

蛋白样品制备过程简而言之就是三步:破碎、沉淀蛋白和去除杂质。虽然说出来不过寥寥的十个字,但是这几个过程经过这么多年,恐怕还没有那位研究人员可以说自己已经完全掌握,面对任何蛋白制备手到擒来。今天就先简单的来说一下破碎这一过程,其他两个步骤方后面详细说:

破碎——最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原则
样品制备的第一步当然是细胞或者其它样品的破碎,这一步看似简单,但是操作中一旦方法不当,就有可能会丢失样品中的蛋白和导致蛋白被修饰。要想毫发无损的通过这一关,首先就要分析样品的来源,是易碎的细胞还是坚硬的组织?是植物细胞还是真菌?要做到有的放矢,才能事半功倍。
破碎的方法有许多种,包括循环冻融法、渗透法、去污剂法、酶裂解法、超声波法、高压法、液氮研磨法、机械匀浆法和玻璃珠破碎法等(可以归纳为机械法、化学法和物理法),这些方法有不同的应用范围,基本的原则都是要以最小的限度减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解变性,这也就是在样品制备破碎这一步的关键所在。抑制蛋白酶降解,减少操作过程温度或者其他物理化学条件对蛋白质变性的影响,减少核酸污染对后继电泳等分析的污染,都是破碎过程需要考虑的问题。

除此之外,为了达到更好的后续抽提效果,G Biosciences发明了一种用于样本研磨的小工具,或许可以给你带来事半功倍的效果。EZ-Grind是一种分装到1.5ml的研磨管中的高效的研磨树脂,同时配套有研磨棒。树脂用于最适的研磨生物样本从而来提取蛋白和DNA,同时树脂是中性摩擦材质不会结合蛋白或核酸。树脂,研磨棒,研磨管的配套组合可以高效破坏组织,细胞,细胞核和其他细胞器。它以做到10分钟内一个管里可以处理100mg样本,非常实用,真正想科学家之所想。


华雅思创生物G-Biosciences全国授权代理

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