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WGA技术如何选择?

发布时间:2021-07-13

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单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项技术,其原理是对分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增,获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序,广泛应用于癌症研究、胚胎发育、辅助生殖、细胞分化、免疫机制、微生物等方向的研究。
  获得高覆盖度高保真性的全基因组扩增产物是准确全面的测序结果的保障。为了保证基因组高覆盖度无偏好性的扩增,在单细胞测序技术诞生的近二十年时间里,全基因组扩增技术经历了几次重大的变革,WGA主要有三种方式:DOP-PCR,MDA,MALBAC。下面小编就来为大家介绍一下WGA技术的演变历程,以及怎样根据实验目的选择相应的扩增方式。

 

 

DOP-PCR

 

 

(Degenerate Oligonucleotide–Primed Polymerase Chain Reaction)

  技术原理:简并寡核苷酸引物PCR,引物的3' 含6bp的随机序列,可以随机的和基因组DNA结合,从而实现对全基因组的扩增[1]。

  应用范围:因为PCR的指数扩增特性,放大了基因组上不同序列之间的差异,因而导致扩增出的基因组覆盖度较低。尽管如此,在1M bin size的水平上,DOP-PCR适合对染色体的CNV进行定量。
 商品化试剂盒:Sigma-Aldrich, GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit

  

 

 

 

 

MDA

 

 

(Multiple Displacement Amplification)

  技术原理:2001年由Laskin团队发明,使用随机的六聚体引物和φ29DNA聚合酶进行反应,该聚合酶具有很强的链置换特性,能够在等温的条件下,扩增产生50~100kb的核酸片段。同时由于其3’-5’核酸外切酶活性和校对活性,φ29 DNA聚合酶具有很高的复制保真性[2]。
  应用范围:MDA法比DOP-PCR拥有更高的基因组覆盖度,φ29 DNA聚合酶的高效率及高保真性,使得MDA法在对SNV的分析,以及构建大片段文库上有着显著优势。但是,和DOP-PCR相同,MDA法依然是指数扩增,因此依然存在PCR反应的序列偏好性,然而,和DOP-PCR不同的是,这种偏好性并不能重复,因此MDA法不适合进行CNV的分析。

  商品化试剂盒:Qiagen, REPLI-g Single Cell Kit。 

   

 

 

 

 

 

MALBAC

 

 

 (Multiple Annealing and Looping–Based Amplification Cycles)

  技术原理:2012年由谢晓亮团队发明,拟线性的扩增过程降低了指数扩增的序列偏好性。扩增引物的5’含有27bp的共同序列,3’是8bp的随机序列,可以和模板在15~20℃的低温下结合,经过8~12个循环的拟线性扩增后,再对这些环状的扩增子进行指数扩增[3]。
  应用范围:MALBAC法的优势在于,虽然它依然存在一定的序列偏好性,但和MDA不同,MALBAC的这种偏好性在不同的细胞之间是可重复的,因此可以通过对参考细胞标准化后,进行CNV的分析;另外,由于其扩增的均一性,MALBAC法扩增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱点在于,它使用的聚合酶保真性不如φ29,因此MALBAC在检测SNV时将会出现更多的假阳性;另外,由于它可重复性的序列偏好性,基因组上低扩增的区域有时会在扩增过程中丢失。

  商品化试剂盒:Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit.

 

 

 

由上述的分析可见,MDA和MALBAC各有优劣,实际上在不同的文献中,研究者也会根据研究目的的不同,采取不同的方式对基因组进行扩增,以满足研究的需要[5-7]

 

 

 

picoplex特殊随机引物起始的热循环扩增

 

 

 
 

picoplex技术相比于以往的PCR、MDA、MALBAC为基础的单细胞全基因组扩增技术,操作简便,扩增重复性良好。特别设计的随机引物(参加US patent 8,206,913)能减少引物二聚体的形成,从而提高引物和模板的配对效率。

 

 

 

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