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胰酶消化法培养原代细胞实验_干细胞搜网_www.stemcell.so

发布时间:2014-05-13

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胰酶消化法培养原代细胞实验原文链接:http://www.stemcell.so/article-837.html

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实验方法原理 

将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用 EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。因此,较为严格地说是指成功传代之前 的培养,此时的细胞保持原有细胞的基本性质,如果是正常细胞,仍然保留二倍体数。但实际上,通常把*代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。zui常 用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。
 

实验材料 

胎鼠新生鼠


试剂、试剂盒 

1640培养基牛血清胰酶Hank’s液碘酒


仪器、耗材 

培养箱 培养瓶 青霉素瓶 小玻璃漏斗 平皿 吸管 移液管 纱布 手术器械 血球计数板 离心机 水浴箱


实验步骤 
一、实验材料准备

1.  Hank’s液配方:KH2PO4 0.06 g,Nacl 8.0 g,NaHCO3 0.35 g,KCl 0.4 g,葡萄糖1.0 g,Na2HPO4·H2O 0.06 g,加H2O至 1 000 ml。Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。

二、具体操作

1.  将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死,置75%酒精泡2-3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏,置平皿中。
 
2.  用Hank’s液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。
 
3.  用手术剪将肝脏剪成小块(1 mm2),再用Hank’s液洗三次,转移至小青霉素瓶中。
 
4.  视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20-40分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。
 
5.  加入3-5 ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。
 
6.  静置5-10分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中。
 
7.  1 000 rpm,离心10分钟,弃上清液。
 
8.  加入Hank’s液5 ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。
 
9.  加入培养液1-2 ml(视细胞量),血球计数板计数。
 
10.  将细胞调整到5×105/ml左右,转移至25 ml细胞培养瓶中,37℃下培养。

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