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在免疫印迹中防止高背景的小诀窍

发布时间:2021-09-13

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   在免疫印迹实验中遇到的质控问题之一最常见的就是高背景。当一个高的背景发生时,很难从不相关的数据中区分出相关的数据。一个常见的高背景可以由于很多原因导致同时需要一些工作来解决 -- 因为不解决这些问题,这个印迹无法读取.


保证缓冲液没有被污染

   一个被污染的缓冲液在免疫印迹中很容易导致高的背景。大多数情况下,由于细菌的存在会导致被污染的缓冲液 -- 但是也有其他的污染物. 当污染物进入到缓冲液中后,他们会影响整个印迹的整体, 包括背景. 解决这种干扰的办法是将旧的缓冲液全部扔掉,重新配置新缓冲液。


确保操作步骤是完全恰当的

   另外一个能够导致高背景的原因是没有进行恰当的操作步骤。差的膜操作,膜过度曝光, 以及不足的漂洗都会导致高背景。这些问题可以通过恰当操作来解决。当膜变干的时候膜的糟糕操作通常会发生。如果没有使用正确的化学试剂恰当的润湿膜会变干; 通常来说是甲醇.

膜的过度曝光也是一个问题 -- 但是它很容易解决. 你所要做的是将膜曝光的时间缩短. 同样的,不充分的漂洗只是需要将冲洗更加充分彻底. 漂洗用来去掉过量的抗体. 当很多抗体存在印迹上时很难将印迹和背景区分开来。改进的漂洗也可以通过使用更好的漂洗溶液来进行。


去除不充分的封闭

    没有正确的封闭, 免疫印迹的结果无法容易读取. 不充分的封闭通常发生因为在孵育过程中的问题. 如果孵育的时间不足够长,正确的区域不能得到封闭. 如果孵育的温度不正确的话,封闭也不能完成. 也有化学试剂可以加入到这个过程中来进一步提高封闭


保证封闭剂的兼容性

   封闭剂, 如同在印迹实验中使用的其他产品一样,需要根据特定的应用进行调整. 使用错误的封闭剂很容易导致干扰和很差的难区分的印迹. 一些封闭剂基于血清蛋白的,而其他的是基于蛋白的。不同的抗体可以和封闭剂有潜在反应,所以有必要找到最合适的封闭剂. 无蛋白的封闭剂是良好封闭剂之一也是最容易的溶液.


降低抗体的浓度

  通常高浓度的抗体会导致高的背景. 因为抗体浓度太高了,整个膜会被抗体所包被. 这会使得出决定性的结论很难. 当提到高浓度的抗体,只有很少一些解决方案可以解决。抗体可进行恰当漂洗或更低浓度的抗体可以被使用. 膜或许也需要恰当的处理 -- 只要没有过度干掉 -- 它不会吸收很多的抗体溶液

高背景也会发生当使用的化学试剂和耗材不合适或质量很差. 在免疫印迹中高背景是经常显著发生的多种问题之一

其他需要考虑的因素之前已经讨论了就是转印膜的选择: PVDF膜或硝酸纤维素膜  - 哪种膜最好?一个经常被忽视的问题是膜的效期在使用膜之前, 确保它没有过期同时被正确储存



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