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核酸纯化试剂的使用方法和注意事项

发布时间:2022-09-08

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   核酸纯化试剂是我们实验室常用的实验,常说的核酸纯化是指分离核酸物质DNA/RNA和蛋白质、多酚、多糖等其他高分子物质,那么,下面一起了解下核酸纯化试剂使用方法和注意事项吧!
  01、保持核酸分子一级结构的完整性
  02、尽量排除其他分子的污染,保证核酸样品的纯度
  细胞分裂
  1、物理作用:低渗透分解、超声波分解、冻融分解、研磨、匀浆等。 用玻璃珠、超声波、研磨等方法破碎细胞;
  2、化学作用: CTAB法、SDS处理等;
  烷基三甲基溴铵是阴离子清除剂,溶解细胞膜,与核酸形成复合体。 该复合体可溶于高盐溶液,可用有机溶剂提取,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后,加入乙醇沉淀,从而分离核酸。
  碱分解法是质粒DNA的常用提取方法。 染色体DNA远大于质粒DNA分子,染色体DNA为线状分子,而质粒DNA为共价键环状分子。 用碱处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易变性。 共价键环状质粒DNA恢复中性PH后恢复天然构象,变性染色体DNA的片段与变性蛋白质和细胞片段结合沉淀,成为具有复性的超螺旋质粒DNA
  3、酶作用:加入溶菌酶和蛋白酶等
  在纯化具有细胞壁的微生物样本时,加入溶菌酶等溶解细胞壁,进行以下分离和纯化。 蛋白酶k是从白色中分离出来的强力蛋白溶解酶,用于清除核酸酶和其他蛋白污染。
  分离和纯化
  1、加入浓盐溶液:盐浓度不同的溶液中,DNA、RNA的溶解度不同
  2、加入SDS :将核酸从蛋白质上游分离出来
  3、萃取:疏水性蛋白在有机相中,核酸残留在上层水相中
  4、硅胶吸附:硅胶膜吸附核酸
  5、磁珠吸附:利用磁珠选择性吸附核酸
  分离方法的优缺点:
  1、RNA回收效率高、耗时长、不利于自动化,也不利于基因组DNA污染
  2、盐析法:产量低,不适合自动提取
  3、硅胶吸附法:纯度高、简单方便、无毒性、可自动化
  4、磁珠吸附法:产量高、纯度好,可以实验特异种的核酸分离,可以自动化
  5、加热煮沸法:只用于纯化DNA,成本低、纯度低、产量低
  清洗和溶解
  清洗:进一步除去杂质,通常使用75%乙醇
  溶解:一般使用无核酸酶水或TE缓冲液