Gibco 0.25% Trypsin-EDTA 消化贴壁细胞 Protocol：步骤、时间、终止方法

本文以 Gibco™ Trypsin-EDTA (0.25%) 含酚红（25200072 / 25200056） 为例，系统讲解贴壁细胞消化的标准操作流程、不同细胞的消化时间参考，以及如何正确终止消化。配套产品请见：Gibco 胰酶 25200072/25200056 产品页。

一、原理简述

胰·蛋白酶（Trypsin）能水解细胞间及细胞与基质间的蛋白质，使贴壁细胞脱落；EDTA 螯合 Ca²⁺/Mg²⁺，削弱细胞间连接、增强胰酶作用。两者协同（0.25% Trypsin + 0.53 mM EDTA·4Na）形成高效、温和的消化液，是贴壁细胞传代的首·选。

为什么用 0.25% 而非更高浓度？过高浓度胰酶易损伤细胞膜、降低活率。0.25% 是兼顾效率与细胞友好的通用浓度，适用于绝大多数传代细胞系。

二、操作前准备

• 试剂：Gibco 0.25% Trypsin-EDTA（含酚红）、PBS（无钙镁）、完·全培养基（含血清）；

• 设备：37℃ 培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器；

• 胰酶提前从 -20℃ 取出，2–8℃ 或室温平衡（避免结冻块），勿 37℃ 长时间加热。

三、标准分步 Protocol

• 弃旧液：在超净台吸弃培养瓶中的旧培养液。

• PBS 洗涤：加入适量无钙镁 PBS，轻轻晃动后吸弃，重复 1 次，去除残留血清（血清会抑制胰酶）。

• 加胰酶：按瓶底面积加入适量 0.25% Trypsin-EDTA，刚好覆盖底面（如 T25 约 1–2 mL）。

• 孵育消化：37℃ 孵育 1–5 分钟；亦可室温消化，时间略延长。期间在显微镜下观察。

• 镜下判断：当细胞变圆、间隙增大、轻拍瓶壁可见细胞滑动，即可终止（勿过度）。

• 终止：加入 ≥ 等体积的含血清完·全培养基（血清终止胰酶活性），轻柔吹打使细胞脱壁成悬液。

• 收集离心：转移至离心管，约 1000 rpm（≈150–200×g）离心 3–5 分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬、计数、接种。

四、常见细胞消化时间参考

注：时间受细胞密度、传代次数、胰酶批次影响，首·次以显微镜观察为准，宁可偏短、多次检查。

五、如何正确终止消化

含血清培养基终止（最·常用）：血清中 α2-巨球蛋白抑制胰酶活性，加入 ≥ 等体积完·全培养基即可。

胰酶抑制剂：如大豆胰酶抑制剂（SBTI），用于无血清体系。

切勿用 PBS 单独终止：PBS 不含抑制物，胰酶仍可能继续作用损伤细胞。

六、注意事项

• PBS 洗涤务必·用无钙镁配方，否则钙镁离子抑制胰酶；
• 避免过度消化（细胞成团、活率下降）；
• 胰酶避免反复冻融，建议分装；
• 含酚红版本一般不影响常规实验，但对雌激素受体/荧光检测敏感者请改用无酚红版（见含酚红 vs 不含酚红）。