ProteanFect助力中大团队开发BmTyr邻近标记平台，揭秘原代T细胞核内新机制

导语：邻近标记（Proximity Labeling, PL）是绘制细胞“空间蛋白质组学"的神兵利器，但面对原代T细胞这类“硬骨头"（难转染、体外存活短），传统工具往往力不从心。近期，中山大学肿瘤防治中心的研究团队在BBRC上发表了一项创新工作：他们基于酪氨酸酶BmTyr搭建了一套生物正交邻近标记平台在该研究中，团队借助 Nanoportal Biotech 自主研发的 ProteanFect® 功效型转染试剂，成功攻克了原代 T 细胞极难转染的传统痛点，高效递送 mRNA 并实现了亚细胞水平的精准标记。 结合全新的 HiBiT/His 双标签系统，该团队成功绘制了原代 T 细胞的核蛋白组动态图谱，并意外发现了蛋白 NKAP 的“染色质定位"新功能。

研究背景：邻近标记的“阿喀琉斯之踵"

想要知道细胞内谁和谁互作、特定细胞器里有哪些蛋白，传统方法是裂解细胞后做Co-IP，但这会破坏瞬时互作，还可能产生人为假阳性。邻近标记技术（如BioID、APEX2）通过表达融合酶，在活细胞内给“邻居蛋白"贴标签，再结合质谱分析，规避了这些问题。

但现有工具各有短板：

·  BioID/TurboID（生物素连接酶）：依赖内源生物素途径，背景高；

·  APEX2（过氧化物酶）：需要添加具有细胞毒性的 H₂O₂，对娇贵的原代细胞（如悬浮生长的T细胞）很不友好；

通用痛点：原代T细胞极难转染，且体外培养寿命短，常规质粒或病毒转染引发的先天免疫响应还会干扰免疫信号研究。

为此，该研究团队将目光投向了 BmTyr（细菌酪氨酸酶）。这是一种铜依赖酶，能将苯酚探针氧化为邻醌，进而标记邻近蛋白。它不需要H₂O₂，条件温和，非常适合敏感的原代细胞。

核心创新：一套“好用、灵敏、易洗脱"的全新工具箱

1. 优化探针与反应体系 

团队比较了传统的生物素-苯酚（Biotin-phenol）和分子量更小的炔基-苯酚（Alkyne-phenol）(图1A)。对炔基苯酚浓度进行了滴定。浓度低于0.015 mM未检测到信号，而0.5 mM导致弥散的非核标记，表明是非特异性探针结合。中间浓度0.15 mM炔基苯酚提供了最佳的信号背景比和精确的核限制性（图1D和E）。他们还将酶定位在细胞核（mCherry-BmTyr-H2B），验证了其在亚细胞水平上的精准标记能力。

图1 生物素-苯酚与炔基-苯酚探针在BmTyr介导的邻近标记中的比较

2. 攻克“洗脱难"：HiBiT/His 双标签系统 

这是本文的一大技术亮点。传统的富集金标准是用叠氮-生物素（Azide-biotin）结合链霉亲和素（Streptavidin），但生物素-亲和素结合太牢，洗脱极其困难，导致后续Western Blot验证效率低下。

解决方案：合成一种定制的叠氮-HiBiT标签，用于与炔基标记的蛋白质组偶联（图2A）。

His标签：负责通过Ni-NTA磁珠高效捕获和温和洗脱蛋白；

HiBiT标签：这是一个仅11个氨基酸的微小肽段，能与LgBiT蛋白互补形成纳米萤光素酶，实现超灵敏的化学发光检测（无需抗体！）。

为降低成本，团队将定制的叠氮-HiBiT标签与市售的叠氮-6×His或叠氮-10×His标签按等摩尔比混合（图2B和C）。两种His标签变体都成功富集了炔基标记的蛋白质组，其中叠氮-10×His提供了略优的富集效率（图2D和E）。随后的HiBiT标签实现了对洗脱蛋白的灵敏化学发光检测，满足了高灵敏度， 生物正交性， 高效洗脱性的初始设计标准。

图2利用双叠氮标签系统对邻近标记蛋白质组进行免疫沉淀及化学发光检测

3. BmTyr用于原代T细胞核蛋白质组的质谱分析 

平台应用于原代T细胞解决方案：

·  递送：采用ProteanFect介导的mRNA转染，12小时内即可表达蛋白，避免了DNA引起的cGAS-STING通路激活（这点在免疫细胞中至关重要），转染效率超50%（图3C）。

·  安全性：优化了Cu²⁺浓度（仅10 μM，远低于常规CuAAC的4 mM），流式细胞术证实对T细胞无明显毒性（图3A）。

随后，将这一优化系统应用于分析肿瘤坏死因子-α（TNFα）刺激后T细胞核蛋白质组的变化。构建野生型（WT）和TNFR1敲除（TNFR1-KO）T细胞，使其表达核定位的mCherry-BmTyr-H2B融合蛋白，用TNFα（10 ng/ml，6小时）处理并进行邻近标记。质谱分析鉴定出116个变化显著的核蛋白，其中20个蛋白在WT+TNFα组中特异性富集，且在TNFR1-KO组中无变化（图3F），主要涉及转录和表观遗传调控，完·美验证了平台的可靠性（图3G）。

图3原代T细胞核蛋白质组的邻近标记与质谱分析

生物学发现：绘制图谱与NKAP的新故事

NKAP是NF-κB激活蛋白，已知TNFα刺激后核转位，但其染色质结合机制未知，故被选为验证靶点。

·  利用新的HiBiT/His标签系统捕获发现：TNFα刺激后，与染色质关联的NKAP显著增多，而总核蛋白水平变化不大（图4B）。

·  在骨髓来源巨噬细胞（BMDM）中重复实验，得到完·全一致结果：NKAP以TNFR1依赖的方式结合染色质这一现象，在不同原代细胞中可重复，进而佐证了本研究体系具有普适性，而非T细胞特·有（图4E）。

这意味着，TNFα-TNFR1信号并未简单改变NKAP的总量或核质分布，而是促进了NKAP与染色质的稳定结合（可能涉及HDAC复合物），为其转录抑制功能提供了新视角。

图4 NKAP作为TNFα信号通路染色质相关下游效应分子的验证

总结与展望

这项研究开发的 BmTyr 无生物素邻近标记平台，以温和低毒、高效精准、兼容点击化学的核心优势，彻·底解决了原代 T 细胞等难转染细胞的亚细胞蛋白质组解析难题。

    值得一提的是，Nanoportal Biotech 的 ProteanFect® 转染试剂在本次攻坚克难中展现了卓·越的性能——它不仅攻克了原代免疫细胞“难转染"的阿喀琉斯之踵，更以高效率、低毒性、不激活先天免疫的高标准，完·美保障了后续质谱鉴定与功能验证的顺利进行。  

    ProteanFect® 始终致力于为“难转染"细胞与前沿递送研究提供最·强技术底座。无论您的研究是深耕空间蛋白质组学，还是聚焦前沿基因与细胞治疗，ProteanFect® 都能助力您的科研工作加速冲刺！

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