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免疫细胞常用分离、纯化技术

发布时间:2021-12-13

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  各种免疫细胞的分工与协作,共同完成免疫应答及其调控,因此,各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。

  免疫细胞分离的方法有很多,主要是根据细胞的理化性状、功能,以及细胞表面标志等的差异而设计的。粘附分离法、尼龙毛柱分离法等主要根据细胞的属性(如粘附)和功能不同,旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为:巨噬细胞或单核细胞>树突状细胞=抗体产生细胞>B淋巴细胞>T淋巴细胞=红细胞。粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞,如补体细胞毒分离法,洗淘分离法(panning)、流式细胞术分离法,以及免疫磁珠法分离细胞技术等。一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。


Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC)

外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的分离是免疫学研究中的一项基本技术。

  目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation),用此方法分离PBMC纯度可达95%,淋巴细胞约占90%,其中T淋巴细胞占80%,B淋巴细胞占4~10%。ficoll-hypaque混合溶液,又称淋巴细胞分层液,在分离人PBMC时,要求其比重为1.077;分离小鼠单个核细胞时比重为1.080;分离大鼠单个核细胞时比重为1.084~1.087;分离马单个核细胞时比重为1.090。

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免疫磁珠法分离淋巴细胞

  免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合,在外加磁场中,通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中,无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性,不在磁场中停留,从而使细胞得以分离。 

1.根据免疫磁珠(immune magnetic bead,IMB)的种类,免疫磁珠法分离细胞可分为直接法和间接法。直接法即将特异性抗体与磁珠相连,IMB可与表达相应膜抗原的细胞结合,在磁性分离器(磁架)作用下,连有磁珠的细胞被吸附在磁架上,从而与其他细胞分离。间接法即将二抗与磁珠相连,磁珠通过二抗与一抗相结合,一抗与细胞表面抗原结合,因此使磁珠与细胞相连,从而在磁场作用下,对细胞进行分离。直接法分离得到的连有磁珠的细胞可直接用于功能实验或流式细胞仪检测。间接法分离得到的连有磁珠的细胞须再培养2天,待磁珠从细胞上脱落下来,才能进行功能实验或流式细胞仪检测。近年来,开发了生物素标记的单抗--亲和素/链霉亲和素—生物素结合的磁珠实验体系(BAB法)。利用生物素和亲和素之间的高亲和力及生物放大效应来增强IMB与细胞的特异性结合,从而提高细胞分离效率。为了分离后迅速进行分离效果分析,目前有研究者将荧光素(如FITC)标记在亲和素/链霉亲和素表面,使所分离的细胞在流式细胞仪上马上得到检测,从而省去了免疫荧光染色的时间。

 2.根据磁珠结合的细胞与所要获得的细胞的关系,免疫磁珠法分离细胞可分为正选法和负选法。正选法即磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞,负选法即磁珠结合不需要的细胞,游离于上清液的细胞为所需细胞。还有一种基于负选法的高效分离方法,即在实验体系中加入连接有磁珠的多种单抗,通过磁性分离器后,则所有不需要的细胞被吸附在磁架上,未被吸附的细胞为目的细胞。这种方法可一次去除多种细胞,又称鸡尾酒法(cocktail)。    

  免疫磁珠法分离细胞是一种90年代初兴起的新型细胞分离技术,所获细胞纯度高(93%-99%),获率可达90%,活细胞率大于95%,且操作简单,不需使用离心沉淀分离技术,省时且费用低。1.png