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细胞转染实验质量控制贴士

发布时间:2021-12-02

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细胞转染技术是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中,其应用越来越广泛。影响转染效率的因素有很多,细胞株本身的特性和活性,细胞培养条件,转染的DNA或RNA的质量,转染方法,转染试剂的选择等。

转染效率受多种因素影响,主要因素有下面几个:

1.转染试剂

不同细胞系转染效率通常不同,但细胞系的选择通常是根据实验的需要,因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。当然,是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。

2.细胞状态

一般低的细胞代数(<50)能确保基因型不变。转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞,细胞生长旺盛,最容易转染。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化。

3.转染方法

转染时应跟据具体转染试剂推荐的方法,但也要注意,因不同实验室培养的细胞性质不同,质粒定量差异,操作手法上的差异等,其转染效果可能不同,应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。

(1)细胞培养物

不同细胞有不同的培养基,血清和添加物。高的转染效率需要一定的细胞密度,一般的转染试剂都会有专门的说明。推荐在转染前24小时分细胞,这将提供正常细胞代谢,增加对外源DNA摄入的可能。一定要避免细菌,支原体或真菌的污染。

(2)细胞密度

不同的转染试剂,要求转染时的最适细胞密度各不相同,即使同一种试剂,也会因不同的细胞类型或应用而异。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂,最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法,包括适当的接种量和培养时间等等。阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数,有的要求细胞90%汇片;而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在40%-80%之间,总之是尽导致和转染相关的细胞行为的变化。

(3)血清

转染产品配方几经革新后的今天,对于主流的转染试剂来说,血清的存在已经不会影响转染效率,甚至还有助于提高转染效率,如阳离子聚合物等,血清的存在会影响DNA一转染复合物的形成,但只要在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基或PBS来稀释DNA和转染试剂就可以了,在转染过程中是可以使用血清的。不过要特别注意:对于RNA转染,如何消除血清中潜在的RNase污染是值得关注的。胎牛血清(FCS)经常用到,便宜一点的有马或牛血清。

(4)抗生素

目前转染试剂因为全程都可以用有血清和抗生素等添加剂的*培养基来操作,非常方便,省去了污染等麻烦。

(5)氮磷(N/P)比

N/P比是转染效率的关键(为了换算方便,一般以DNA/转染试剂质量比表示),在一定比例范围内转染效率随N/P比成比例增高,之后达到平值,但毒性也随之而增加,因此在实验之前应根据推荐比例,确定本实验的最佳转染比例。

(6)DNA质量

DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术(如脂质体等)基于电荷吸引原理,如果DNA不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。

4.载体构建

转染载体的构建(病毒载体,质粒.DNA,RNA,PCR产物,寡核苷酸等)也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高,但不同病毒载体有其特定的宿主,有的还要求特定的细胞周期,如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞,此外还需考虑一些安全问题(如基因污染)。除载体构建外,载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响,如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用,转染也很难进行,因此选择组成或可调控,强度合适的启动子也很重要,同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。